طلحه و زبیر از اولین کسانی بودند که برای فشار بر عثمان سپاه جمع کرده و ادعای خلافت نیز داشتند. برخی از صحابه از جمله امام علی(ع) و ابن عباس و حسن بصری و مالک اشتر، صریحا به نقش این دو نفر در شوراندن مردم علیه عثمان و زمینه چینی برای قتل عثمان اشاره کرده اند. به خصوص طلحه که منابع تاریخی به دشمنی بسیار شدید و تند او با عثمان، گواهی می دهند.
به هر حال این دو نفر در رفتاری بسیار عجیب و با اینکه نقش مهمی در شورش علیه عثمان داشته اند، بعداز بیعت با امام علی(ع)، وقتی دست خود را کوتاه از خلافت و حتی امارت یافتند، علم خونخواهی عثمان را برافراشتند و به همین بهانه همراه با عایشه بر علیه امام علی(ع) در جنگ جمل شرکت کردند.

امام علی(ع) نامه ای همراه «جرير» به شام فرستاد تا حجت را بر معاويه تمام كند. معاويه دو بهانه براى ترك بيعت داشت، يكى آنكه به هنگام بيعت مردم با امام على(ع) در مدينه حضور نداشته و ديگر اينكه امام، مسؤول خون عثمان است و به اين خاطر نباید با او بيعت كرد؛ ولى حضرت هر دو بهانه را با منطقی روشن از او گرفت و فرمود: اول اینکه بیعت با من نیز مانند بیعت با خلفای گذشته صورت پذیرفته و دیگر اینکه تو خود می دانی در قضیه قتل عثمان من از همه مبرّی ترم؛ امّا معاويه كه دلباخته حكومت بود، از بيعت با امام طفره رفت.

بعد از حوادثی چون کشته شدن خلیفه سوم و جنگ جمل، که راه شوریدن بر ضدّ خلیفه مسلمین پس از جنگ جمل باز شده بود، معاویه عنوان خونخواهى عثمان را دستاویز خود قرار داده به جنگ مستقیم با امام علی(ع) برخاست. او انبوهى از شامیان را بر ضدّ امام بسیج کرد. جنگ صفین 9 ماه طول کشید و با حیله عمروعاص در قرآن به سر نیزه کردن، پایان یافت. در نتیجه، کار به داستان داورى و حکمیّت کشیده شد. داور شام عمرو بن عاص آن فریبکار کهنه کار، داور عراق ابوموسى اشعرى را فریب داد.

طلحه و زبیر که خود از زمینه سازان قتل عثمان بودند، به خاطر نارضایتی که از علی(ع) داشتند و از مخالفت عایشه با انتخاب علی(ع) آگاه بودند او را به خونخواهی عثمان تشویق کردند، تا به بهانه خون عثمان و با کمک عایشه مسیر نیل به قدرت را هموار کنند. آنان با تحریک مردم یک خلیفه را کشتند و با دستاویز قرار دادن خون آن خلیفه بر خلیفه ای دیگر شوریدند.